Produzione biotecnologica di probiotici

I lattobacilli sono i microrganismi dominanti nella flora vaginale di donne sane; la loro funzione probiotica consente di mantenere un ambiente che limita la crescita dei patogeni producendo acidi organici e H2O2. Studi recenti hanno evidenziato inoltre l’attività viralicida di alcune strains.

Da tali studi è nata l’esigenza di sviluppare tecnologie produttive adeguate di ceppi di lattobacilli, in grado di aderire alle mucose vaginali e modulare la composizione della flora del tratto urogenitale per prevenirne le infezioni, da introdurre come componenti attivi di preparazioni alimentari e farmaceutiche e di processi di conservazione ottimali che prolunghino la shelf-life dei lattobacilli prodotti.

BioTekNet è in grado di effettuare la caratterizzazione metabolica e l’ottimizzazione produttiva di strains di lattobacilli vaginali, in particolare di L. crispatus e L. plantarum, e la valutazione della secrezione di H2O2, acido lattico e metaboliti secondari quali i polisaccaridi (EPS), responsabili dell’adesione batterica alle pareti dell’ospite.

E’ inoltre in grado di:

  • determinare le condizioni ideali di conservazione delle biomasse probiotiche in forma liofilizzata;
  • effettuare prove di crescita delle strains selezionate di entrambi i microrganismi per caratterizzare le condizioni ottimali di crescita e produzione di acidi organici su diverse fonti di azoto e carbonio.

Uno dei maggiori problemi legati alla produzione di batteri lattici è costituito dal fatto che la produzione di acido lattico, connessa con il loro stesso metabolismo, ne inibisce la crescita con un meccanismo feedback ed a causa del cosiddetto “effetto lattato”; ne consegue che è difficile ottenere alte rese in biomassa in processi fermentativi tradizionali. In una coltura batch di lattobacilli il limite superiore della concentrazione cellulare è determinato sia dall’esaurimento del substrato che dal basso pH che il mezzo di coltura raggiunge per accumulo di acido lattico durante la crescita dei microrganismi. Qualora il pH del terreno di crescita venga mantenuto al valore ottimale per titolazione con una soluzione alcalina, la massima concentrazione cellulare viene comunque limitata dall'accumulo di lattato. Affinché il processo fermentativo porti all’ottenimento di maggiori densità cellulari bisogna quindi effettuare una rimozione in continuo dell’acido lattico che si accumula nel terreno, in modo da mantenerne la concentrazione al di sotto del limite inibitorio, facendo contemporaneamente in modo da semplificare le procedure di downstream per questa molecola dalle molteplici applicazioni.

I ricercatori afferenti al network BioTekNet sono riusciti a risolvere tale problema, utilizzando, per la fermentazione delle strains batteriche selezionate, un bioreattore innovativo sviluppato dai ricercatori stessi, dotato di moduli di microfiltrazione a fibre cave, che consente di ottenere alte densità cellulari contenendo i costi e i tempi di processo.

Tale bioreattore consente anche il recupero del terreno esausto della fermentazione, da cui è possibile recuperare l’acido lattico con buone rese.

Generalmente, i batteri lattici vengono conservati e commercializzati sotto forma di preparati liquidi, congelati, liofilizzati o essiccati mediante spray drying. Durante questi processi, le cellule vengono sottoposte a condizioni ambientali estreme, che possono danneggiarne la vitalità e la funzionalità, alterando quelle proprietà metaboliche di rilevanza tecnologica che influenzano l’evoluzione del processo fermentativo e, quindi, le caratteristiche organolettiche del prodotto finale. La vitalità dei microrganismi probiotici è inoltre fondamentale ai fini dell’attività benefica sulla salute dell’organismo fruitore. Per questi motivi lo sviluppo di nuove procedure di conservazione e di formulazioni stabilizzate è di notevole interesse applicativo. E’ quindi prioritario per una più vasta applicazione dei probiotici in campo sia alimentare che farmaceutico, individuare una tecnica ottimale per la conservazione delle biomasse prodotte, nel tempo e a diverse condizioni di temperatura, in modo da poterne agevolare il trasporto e lo stoccaggio. Uno dei metodi più utilizzati nella conservazione di microrganismi è la liofilizzazione, che permette, eliminando l’acqua, una lunga conservazione sia a temperatura ambiente che in frigorifero, senza che ciò produca un rapido declino della vitalità microbica. Lo stesso processo di liofilizzazione rappresenta però il momento cruciale nella riduzione della vitalità, in quanto i microrganismi vengono sottoposti a uno shock sia osmotico che termico. Affinché uno starter caseario o un prodotto probiotico possa svolgere correttamente la sua funzione è necessario ridurre il danno durante il processo di liofilizzazione, preservando quanto più possibile la vitalità dei microrganismi.

A tal proposito BioTekNet ha studiato una serie di molecole, quali glicerolo, saccarosio, lattosio, trealosio, destrine e soluti compatibili nella conservazione dei batteri lattici, per individuarne l’efficacia come agenti crioprotettivi durante la liofilizzazione, e come agenti per la conservazione nel tempo anche a temperatura ambiente allo scopo di evitare, o almeno di limitare, i danni causati dalle tecnologie correnti di conservazione. All’attuale stato dell’arte della tecnologia di conservazione si prevede l’uso di sostanze protettive come il glicerolo, il saccarosio, il lattosio.

Difatti le biomasse microbiche di fine fermentazione sono state trattate con diverse soluzioni crioprotettrici e liofilizzate per determinarne la vitalità durante la conservazione.

I risultati ottenuti hanno dimostrato la capacità dei ceppi in esame di crescere su numerosi carboidrati ottenendo elevate rese in biomassa; l’utilizzo della microfiltrazione ha permesso l’ottenimento di una densità cellulare, sia di L. crispatus che di L. plantarum, cinque volte superiore rispetto al processo batch. Anche su risorse rinnovabili come scarti caseari ed estratto di malto i microrganismi hanno evidenziato ottime capacità di crescita e produzione di acidi organici.

Gli agenti protettori utilizzati nelle prove di stabilità sui ceppi selezionati sono stati trealosio, destrine ed ectoine in diverse percentuali. Si è osservato un significativo effetto crioprotettore delle sostanze citate in termini della riduzione della mortalità cellulare dovuta allo shock osmotico e termico della liofilizzazione. Si è notato inoltre un buon andamento della vitalità dei liofilizzati nel tempo.

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Ricercatori

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    • De Rosa Mario

    • Presidente del Consiglio di Amministrazione del Centro Regionale di Competenza in Biotecnologie Industriali BioTekNet S.C.p.A.
    • Professore ordinario di Biochimica presso la Facoltà di Medicina e Chirurgia della Seconda Università degli Studi…

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    • Pavone Vincenzo

    • Vice Presidente e membro del Consiglio di Amministrazione del Centro Regionale di Competenza in Biotecnologie Industriali BioTekNet S.C.p.A.
    • Professore Ordinario di Chimica Generale presso la Facoltà di Scienze MM.FF.NN. dell’Università degli Studi…

    • continua

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